HPLC în determinarea coloranților

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă înlocuieşte vechile metode cromatografice de analiză a coloranţilor alimentari (cromatografia în strat subţire, cromatografia pe hârtie) furnizând rezultate precise, reproductibile şi rapide.

1. Stabilirea naturii colorantului şi extracţia sa din proba de analizat

Se aplica o metodǎ de testare calitativă a produselor alimentare pentru a putea determina natura colorantului introdus în procesul de fabricaţie. Metoda permite stabilirea naturii colorantului folosit şi anume: natural sau sintetic.

Dacă colorantul este sintetic, acesta este extras rapid din probă într-un amestec apă-metanol 7/3. Se observă vizual o colorare intensă a amestecului de extracţie, situaţie care nu apare în cazul în care colorantul este natural.

Dacă în urma acestei testări calitative, se constată prezenţa în probă a unui colorant sintetic, se trece la extracţia acestuia în vederea dozării lui cantitative.

2. Determinarea coloranţilor alimentari sintetici

Este o metodă HPLC de determinare a unor coloranţi alimentari sintetici, şi anume: tartrazină, ponceau 4 R, allura red şi galben de chinolină .

Se încerca mai întâi separarea coloranţilor sintetici menţionaţi utilizând o coloană cromatografică Pecosphere C18, 5 μm, 150 x 4,6 mm (BrownLee), o fază mobilă constituitǎ dintr-un amestec acetat de amoniu:metanol (7:3, v/v) şi un debit al fazei mobile de 0,7 mL/min. Detecţia coloranţilor alimentari sintetici separaţi se efectueaza spectrofotometric, cu ajutorul detectorului diode array al sistemului HPLC.

Coloranţii ponceau 4 R şi galbenul de chinolină au timpii de retenţie foarte apropiaţi şi nu se separǎ. Cu toate că cei doi coloranţi nu se pot separa cromatografic, ei pot fi totuşi determinaţi prin efectuarea de mǎsurǎtori de absorbanţǎ la lungimea de undă de 507 nm pentru determinarea ponceau 4 R (galbenul de chinolină nu absoarbe la această lungime de undă) şi la 413 nm pentru galben de chinolină. De asemenea, în cazul analizei unor probe reale, în vederea identificării compusului separat, este recomandată compararea spectrelor de absorbţie ale compuşilor separaţi (cu timpii de retenţie în jurul valorii de 3 min) cu spectrul fiecăruia din cei doi coloranţi (ponceau 4 R şi galben de chinolină).

Se foloseste o coloană cromatografică cu aceleaşi caracteristici generale, dar produsă de altă firmă (Supelco),si se obţin picuri cromatografice bine separate pentru coloranţii alimentari sintetici

ponceau 4 R şi galben de chinolină. Parametrii metodei cromatografice utilizate sunt prezentaţi în tabelul următor:

coloana Coloana cu faza inversa supelcosil C 18 5µm,

150x4.6 mm

faza mobila Acetat de amoniu 0.1M: metanol : 7:3 (v/v)

Debit 0.7 ml/min

Temperatura coloanei 37°C

detector UV Vis tip Diode Array

Volum de injectie 10µl

În figurile 1 şi 2 sunt prezentate cromatogramele ce se obţin pentru tartrazină şi galbenul de chinolină folosind cea de a doua coloană cromatografică (Supelcosil), precum şi spectrele de absorbţie corespunzǎtoare acestora, spectre trasate cu detectorul diode array al aparatului HPLC.

Spre deosebire de cromatogramele obţinute pentru ponceau 4R, allura red şi tartrazină, în care s-a obţinut câte un pic cromatografic bine definit corespunzător fiecăruia din coloranţii menţionaţi, pentru colorantul galben de chinolină cromatograma este constituită din cinci picuri cromatografice.

Colorantul sintetic galben de chinolină se prezintă sub forma unui amestec de săruri de sodiu ale unor acizi di şi trisulfonici. Numărul şi poziţia grupărilor sulfonice pe nucleul benzenic, explică comportamentul cromatografic diferit al componentelorgalbenului de chinolină.

Figura 1. Cromatograma pentru colorantul tartrazină şi spectrul de

absorbţie corespunzător acestuia

Dacă se compară alura spectrelor de absorbţie corespunzătoare picurilor cromatografice ce se obţin la separarea componentelor galbenului de chinolină (figura 1), se observă că forma acestora este asemănătoare. Acest lucru se poate explica prin faptul cǎ este prezentǎ aceeaşi grupare cromoforǎ în toate componentele amestecului, dar numărul şi poziţia grupărilor sulfonice din molecula acestora determină un comportament cromatografic diferit pentru fiecare component.

În figura 3 este prezentată cromatograma ce se obţine pentru amestecul format din cei patru coloranţi alimentari sintetici analizaţi: ponceau 4R, allura red, tartrazină, galben de chinolină. Studiind cromatograma prezentată în figura 3 se observă cǎ se obţin picuri cromatografice bine definite pentru tartrazină, ponceau 4R şi allura red.