Reactia PCR a fost descoperită în 1983 de către Kary B. Mullis (1993 - Premiul Nobel) şi, după 1988 a cunoscut o dezvoltare explozivă şi o rafinare extraordinară, fiind reacţia care a revoluţionat Biologia Moleculară a Acizilor Nucleici.
Dezvoltarea tehnicii are la bază descoperirea Taq Polimerazei enzima - cheie a reacţiei, o polimerază stabilă la temperaturi înalte (~ 94 °C) la care moleculele de ADN, în mod normal dublu catenare, disociază şi astfel fiecare catena poate fi copiată.
Licenţa de utilizare a reacţiei PCR este deţinută de compania Hoffman La Roche
TEHNICA PCR
Materiale necesare:
ADN de amplificat
Primeri (oligonucleotide, amplimeri)
ADN-polimeraza
dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)
Soluţie tampon (Mg2+ sau Mn2+, K+)
Termociclul
Etape PCR
Reacţia PCR se desfăşoară în 3 etape:
1. Denaturarea: în urma încălzirii amestecului de reacţie la 94ºC, ADN-ul ţintă este separat (denaturat) in 2 catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scăderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor ataşa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;
3. Elongaţia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabilă în prezenţa Mn2+ şi a excesului de deoxinucleotid-trifosfaţi (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina şi deoxiuridina) va extinde primerii ataşaţi în lungul matriţei ţintă şi va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de amplicon ADN.
DENATURAREA
ADN-ULUI
94-98 ºC, timp de 20-30 de secunde
ADN-ul dublu catenar este desfăşurat în două lanţuri complementare, de care se vor lega apoi primerii
La sfârşitul acestei etape în mediul de reactie vor fi prezente două lanţuri ADN simplu-catenare
CUPLAREA PRIMERILOR
Se scade temperatura la 50-65 ºC, timp de 20-40 de secunde.
Primerii sunt în exces în mediul de reacţie
Lanţ dublu-catenar hibrid – primeri şi ADN de amplificat.
Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară, Ion Ionescu de la Brad, Iaşi
Documentul este oferit gratuit,
trebuie doar să te autentifici in contul tău.