Studiul activității oxidoreductazelor

1. Determinarea activităţii peroxidazei

Peroxidaza este o enzimă din clasa oxido-reductazelor care catalizează reacţia generală:

ROOH + AH2 H2O + ROH + A

Substrat redus Substrat oxidat

În care ROOH poate fi: peroxidul de hidrogen sau un alt peroxid organic.

Reacţiile peroxidative catalizate de peroxidază pot avea loc în prezenţa p-crezolului, guaiacolului, rezorcinolului etc. drept cosubstrat. Peroxidaza poate, de asemenea, cataliza şi alte tipuri de reacţii cum sunt: oxidative (în prezenţa oxigenului şi acidului hidroxifumaric, acid ascorbic, hidrochinonă etc.), catalazice (descompunerea de hidrogen şi oxigen molecular hidroxilează tirozina, fenilalanina, p-crezolul, acidul salicilic etc.). Peroxidazele sunt larg răspândite în diferite plante (hrean, ridichi, napi, gulie, cartofi, smochine şi alte legume şi fructe) şi animale (de ex. leucocite, ficat, lapte, salivă etc.). În general peroxidazele au o mare stabilitate termică ( 85 115C) constatându-se adesea reactivarea lor după tratamentul termic al diferitelor materiale care le conţin în special de natură vegetală. Datorită acestui fapt, determinarea activităţii peroxidazei din diferite legume şi fructe supuse tratamentelor termice (de ex. blanşare, sterilizare etc.) este folosită ca indiciu al eficacităţii tratamentului. Determinarea activităţii lacto-peroxidazei este folosită la urmărirea pasteurizării în industria laptelui.

Peroxidazele intervin în degradarea fructelor şi legumelor fiind implicate în modificarea mirosului şi gustului la mazăre, fasole etc., modificarea culorii cartofilor, merelor, gutuilor etc. ( îmbrunare enzimatică).

1.1. Metoda colorimetrică

Principiul metodei

Metoda se bazează pe proprietatea peroxidazei de a oxida în prezenţa apei oxigenate sau a altor peroxizi compuşi de natură aromatică. Rezultă chinone care prin polimerizare dau compuşi de culoare brună (melanine). Reacţia este foarte sensibilă. În acest caz se foloseşte drept cosubstrat o soluţie alcoolică de guaiacol:

Reacţia continuă cu polimerizarea chinonelor şi formarea unor compuşi coloraţi în brun ( melanine).

Reactivi

- soluţie alcoolică de guaiacol 1%;

- apă oxigenată 0,5M;

- clorură de sodiu 2%.

Modul de lucru

Se cântăresc 5-10 g produs şi se mojarează fin cu 25 ml soluţie clorură de sodiu 2%. Se trece conţinutul mojarului cantitativ într-un cilindru gradat de 100 ml cu apă distilată şi se aduce la semn; se omogenizează bine şi se lasă 15 minute pentru extracţie, timp în care se mai agită de câteva ori; se filtrează prin filtru cutat într-un vas curat şi uscat. Din filtrat se iau 10 ml într-un alt vas curat şi uscat, se adaugă 1 ml apă oxigenată 0,5 M, 1 ml guaiacol 1%, se omogenizează şi se lasă la temperatura camerei timp de 30 minute. Se obţine o culoare brună mai mult sau mai puţin intensă în funcţie de cât este de activă enzima.

Se determină extincţia soluţiei la un spectrofotometru, la lungimea de undă de 420 nm, prin cuvă de 1 cm folosind ca fond apa distilată. Dacă soluţia este intens colorată, se face o diluţie corespunzătoare.

Modul de calcul

În funcţie de extincţia determinată şi de diluţiile efectuate, se exprimă activitatea peroxidazei în extincţie pentru 1 g produs.

, în care:

E – extincţia determinată;

G – cantitatea de preparat enzimatic sau sursa de enzimă, în g sau ml;

d – diluţie

2. Controlul inactivării peroxidazei

Principiul metodei

Prin fierberea produselor vegetale peroxidaza este inactivată şi ca urmare reacţia de mai sus nu mai are loc.

Metoda se foloseşte pentru stabilirea timpului de opărire a materiilor prime vegetale necesar inactivării enzimelor de oxido-reducere, deoarece peroxidaza este cea mai termostabilă enzimă din această clasă.

Metoda se bazează pe reacţia de culoare a guaiacolului în prezenţa peroxidazei şi a apei oxigenate ( vezi determinarea colorimetrică a activităţii peroxidazei).