Laboratoare biochimie fizică

Notiuni teoretice

În sistemele acid – baza conjugate, echilibrul de ionizare se poate reprezenta prin schema:

HA H+ + A-

iar constanta de echilibru se mai numeste si constanta de aciditate:

(1)

Pentru a exprima gradul de ionizare al acizilor si bazelor în aceeasi scara, asa cum valoarea pH-ului caracterizeaza si bazicitatea si aciditatea, Brönsted (1923) a introdus pentru ionizarea bazelor un formalism analog:

BH+ B + H+

(2)

Întrucât constantele de ionizare au în general valori mici, practic se folosesc logaritmi lor

cu semn schimbat: pKa = - logKa

Ecuatiile (1) si (2) se pot scrie deci în forma:

(3)

(4)

Pentru determinarea valorii pKa pe cale spectrofotometrica se înregistreaza spectrele de absorbtie ale substantei studiate într-o serie de solutii tampon cu diferite pH-uri, în care suma concentratiilor speciilor HA si A- este constanta. În aceste conditii:

unde EA si EHA - extinctia solutiei care contine numai forma A- sau HA (la pH-uri limita)

E - extinctia solutiei de analizat care contine ambele forme.

înlocuind în relatia (1) se obtine:

(5)

sau în forma logaritmica:

(6)

Din ecuatia (3) rezulta ca la ½pH - pKa½ = 2 în solutie exista 99% din una din formele acid - baza conjugate si 1% din cealalta. Întrucât masuratorile spectrofotometrice au o precizie de cca 1%, se poate considera ca tot intervalul de pH în care ionizarea produce variatii apreciabile în spectre se gaseste în limitele pKa ± 2. De aceea spectrul substantei în orice solutie cu pH ³ pKa + 2 poate fi considerat ca spectrul formei A-, iar în orice solutie cu pH £ pKa - 2, ca spectrul formei HA.

Metoda standard de determinare a valorii pKa cuprinde urmatoarele etape:

1. Trasarea spectrelor de absorbtie a celor doua forme acid - baza

Pentru aceasta se obtin spectrele substantei în solutii de HCl 0,1 N si 0,01 N si apoi de NaOH 0,01 N si 0,1 N care corespund la valorile de pH: 1; 2; 12; 13. Daca valoarea pKa a substantei se gaseste în limitele 4 - 10, atunci spectrele obtinute la pH 1 si 2 coincid si corespund formei HA pure, iar cele de la pH 12 si 13 - formei A-.

2. Alegerea lungimii de unda analitice din spectrele formelor acid - baza

În acest caz lungimea de unda analitica (la) va fi aceea la care diferenta între coeficientii molari de extinctie ai celor doua forme acid - baza este maxima. În continuare, toate masuratorile se vor face numai la aceasta lungime de unda, iar în calcule se vor folosi valorile EHA si EA obtinute la punctul 1 la la.

3. Metode standard de determinare a valorii pKa

Se foloseste o solutie de studiat în tampon la un astfel de pH încât în solutie sa existe formele HA si A- în concentratii comparabile. Se determina apoi extinctia solutiei la la si se calculeaza valoarea pKa aproximativa dupa ecuatia (6).

4. Determinarea exacta a valorii pKa

Cunoscând valoarea pKa aproximativa se pregatesc 6 - 8 solutii tampon cu valori de pH cuprinse în intervalul pKa ± 0,6. Determinând extinctiile acestor solutii la la se calculeaza valorile pKa (tot dupa ec. 6) si se ia media.

Modul de lucru

Se va determina constanta de aciditate a acridinei (C13H9N, M = 179,21).

Solubilitatea acridinei în apa la 20°C este de 3 ´ 10-4 M. Solutia cu o astfel de concentratie este prea diluata pentru determinarea valorii pKa pe cale potentiostatica. Constanta de aciditate a acridinei a fost determinata exact pe cale spectrofotometrica datorita faptului ca molecula neutra (baza libera B) prezinta o absorbtie puternica în domeniul ultraviolet si practic neglijabila în domeniul vizibil, în timp ce cationul (BH+) este colorat (având o banda caracteristica în vizibil).

1. Determinarea Constantelor de Echilibru in Sisteme Acid - Baza

2. Determinarea prin Chemiluminescenta a Activitatii Pro si Antioxidante a Biomoleculelor

3. Dotarea Catalizei

4. Stingerea Fluorescentei unei Solutii de Fluoresceina prin Ioni de Iod