Laboratoare Agronomie

OBtINEREA sI FUZIUNEA PROTOPLAsTILOR

Definitie:

Protoplastii sunt structuri celulare vegetale, sferice, izolate prin eliminarea enzimaticã a

peretelui celular pectocelulozic. În alcãtuirea unui protoplast se regãsesc: plasmalema,

citoplasma, nucleul, vacuola si organitele citoplasmatice – cloroplaste si mitocondrii.

Proprietãti ale protoplastilor:

- îsi pãstreazã potentialul de regenerare a peretelui celular

- îsi pãstreazã capacitatea de crestere si diviziune

- pot fi izolati dintr-o gamã largã de tesuturi si organe vegetale tinere

- pot fuziona

Obtinerea protoplastilor

Principiul metodei constã în disocierea celulelor si degradarea peretelui celular,

concomitent cu deshidratarea partialã a citoplasmei, protoplastii fiind recuperati prin centrifugare

si spãlare.

Peretele celular la plante este alcãtuit dintr-o membranã plasmaticã (plasmalema) si o

membranã scheleticã, ultima fiind alcãtuitã din celulozã si pectinã. La celulele izolate, peretele

celular reprezintã o barierã în circulatia substantelor, astfel cã acesta trebuie degradat, lucru

posibil pe cale mecanicã (centrifugare) sau pe cale enzimaticã (solutii cu pectinaze si

celulaze).

Etapele unei culturi de protoplasti:

1.Stabilirea surselor de material biologic, eventual sterilizarea lor

2. Pregãtirea materialului biologic pentru izolarea protoplastilor

3. Izolarea protoplastilor

4. Cultura de protoplasti

1. Stabilirea surselor de material biologic. Materialul biologic vegetal folosit pentru

izolarea protoplastilor poate fi reprezentat de: frunze tinere, apexuri, rãdãcini, fructe, coleoptile,

nodurile rãdãcinilor, tesuturi embrionare meristematice, cotiledoane, embrioni, microspori,

petale de flori, suspensii celulare embriogene.

Cele mai utilizate sunt: mezofilul foliar, culturile de calus sau de celule in vitro si

suspensiile celulare.

2. Pregãtirea materialului biologic. Cu exceptia suspensiilor celulare, materialul

biologic se sterilizeazã, se spalã si se scarificã cu scalpelul, apoi se introduce într-o solutie

hipertonicã (ex. metanol) pentru realizarea plasmolizei (pierderea apei pe principiul osmozei

duce la îndepãrtarea plasmalemei de peretele celular). Celulele plasmolizate capãtã aspect sferic,

peretii celulari pectocelulozici rãmânând intacti (Fig.1.,2.).

Fig.1. Celule de Elodea în timpul plasmolizei (Armstrong W.P., 2001)

2

Fig.2. Celule de Elodea înainte si dupã plasmoliza în solutie de NaCl 10%

(Armstrong W.P., 2001)

A. Peretele celular pectocelulozic

B. Protoplast (continut celular deshidratat partial, concentrat în centrul celulei)

C. Spatiul dintre protoplast si peretele celular

3. Izolarea protoplastilor se realizeazã cu ajutorul unor solutii enzimatice, la întuneric

si la cca. 25oC, care distrug peretii celulari (pectinaza determinã disocierea celulelor si celulaza

determinã degradarea peretelui celular). La speciile la care nu se pot izola protoplasti din

mezofilul foliar, se folosesc suspensii celulare embriogene rezultate prin cultivarea “in vitro” a

meristemelor apicale, cu sau fãrã celule “doicã” (celule din aceeasi specie sau alte specii,

introduse în mediul de culturã, care favorizeazã reconstituirea peretilor celulari). Solutiile cu

protoplasti se decanteazã si se filtreazã.

4. Cultura de protoplasti se realizeazã pe mediu lichid sau solid (Fig.3.), când se divid,

rezultând un microcalus din care se pot diferentia structuri embrionare globulare, respectiv

embrioni somatici (Fig.4., 5.). Prin transferarea embrionilor pe mediu agarizat, se pot dezvolta

plante identice cu plantele initiale. Prin aclimatizarea acestora si transferul în câmp, rezultã

culturi asemãnãtoare celor obtinute prin metodele traditionale de înmultire.

Fuziunea protoplastilor

Procesul de fuziune a protoplastilor constã în parcurgerea a 2 faze:

A. Contactul membranar în câmp de curent electric alternativ

B. Fuziunea în câmp de curent electric continuu (electrofuziune)

În mediul cu protoplasti se introduc electrozi sterilizati în prealabil, la bornele cãrora se

aplicã o tensiune alternativã de mare frecventã pentru alinierea protoplastilor, apoi socuri

electrice de curent continuu, pentru realizarea fuziunii acestora (Fig. 4.B.). Pot rezulta fuziuni

binare (câte 2) sau multifiziuni (mai mult de 2 protoplasti fuzionati), întreg procesul fiind urmãrit

la microscopul optic.