Criofracturarea

Criofracturarea este o metodă folosită în tandem cu procedura de examinare în microscopie electronică.

Metoda constă în fracturarea unei probe biologice congelate. Detaliile expuse prin fracturare (planul de fractură) sunt accentuate prin depunerea unui strat subțire de platină/carbon peste planul de fractură; depunerea stratului are loc sub vid. Se realizează o replică (copie perfectă negativă), care poate fi examinată în microscopie electronică de transmisie.

Imaginile furnizate de tehnica de criofracturare urmată de examinarea cu ajutorul microscopului electronic de transmisie au schimbat modul de înțelegere a morfologiei funcționale a celulei, deoarece a permis accesul la zone inaccesibile doar prin tehnic de secționare. Este o metodă specială de vizualizare a feţei interne a biomembranelor.

Metodă

Celulele sunt congelate în N2 lichid (-196°C), indirect, într-un sistem bain-marie cu izopentan; piesa este imersată în izopentanul răcit indirect de azotul lichid (fig.2_1). Congelarea are loc în prezenţa unui agent de crioprotecţie pentru a preveni distorsiunile (artefactele) determinate de formarea cristalelor de gheaţă.

Ulterior blocul de gheaţă format este spart cu ajutorul unui cuţit (fig. 2_2, 2_3). În cazul examinării membranelor celulare, planul de fractură traversează adesea planul hidrofob al stratului bilipidic al plasmalemei.

Feţele de fractură rezultate sunt acoperite prin pulverizare sub vid cu un strat subţire de platină-carbon. Stratul de carbon se face prin depunere verticală (fig 2_4). Depunerea platinei se face sub un anumit unghi astfel încât unele zone captează mai mult metal şi determină un aspect „de umbră” sub incidenţa unui fascicul de electroni (fig. 2_5). Se obține o replică de platină-carbon care este curățată și examinată cu ajutorul microscopului electronic de transmisie.

Se obține o replică de platină-carbon care este curățată și examinată cu ajutorul microscopului electronic de transmisie. Curățarea se realizează la presiune atmosferică și temperatura camerei, cu ajutorul unei soluții de hipoclorit de sodiu.

Fig.2. Etapele tehnicii de criofracturare.

2_1: etapa de congelare;

2_2 sistemul de fracturare;

2_3 detaliu asupra fenomenului de fracturare a probei congelate;

2_4 depunerea stratului de platină (vaporizare sub vid, unghi <90°);

2_5 depunerea stratului de carbon (vaporizare sub vid = 90°C).